MICORRIZAS ARBUSCULARES : APLICACIÓN PARA EL MANEJO SOSTENIBLE DE LOS AGROECOSISTEMAS

Gloria A. Corredor H.*

Estudios desarrollados en los cultivos de plátano, yuca y ñame de pequeños y medianos productores de la Costa Atlántica, han demostrado que existen varios limitantes relacionadas con el manejo fitosanitario, agronómico y de comercialización de estos cultivos.

Estos limitantes se han abordado implementando diferentes estrategias, lo que ha permitido el establecimiento de un programa multidisciplinario para abordarlas y solucionarlas, acercando nuevas tecnologías al agricultor que permitan un desarrollo competitivo y sostenible de su cultivo, el establecimiento de programas de desarrollo tecnológico, permitirá conseguir un impacto final de tipo socioeconómico en la región.

Dentro del desarrollo del proceso productivo de semillas limpias de cualquier especie, la etapa de adaptación de las plántulas bajo condiciones de invernadero núcleo y vivero, es particularmente crítica, y en general, un buen desarrollo del cultivo en el campo, reflejado

en el aumento de los niveles de productividad, dependen en gran medida de los niveles de adaptativos iniciales y nutricionales a los que la planta sea sometida durante todo su ciclo, por lo que es necesario desarrollar una estrategia que facilite y que asegure las dos etapas y lleve a la obtención mayores rendimientos del cultivo.

Importancia y Aplicación de las Micorrizas Arbusculares.

Que nos motiva a la aplicación de micorrizas ?

En el año 2025, se prevé que la población para América Latina y el Caribe alcanzará la cifra de 799 millones de habitantes, con relación a 40 millones en 1985, es decir que en 40 años prácticamente se duplicará la población. Para satisfacer las crecientes demandas de la región es necesario incrementar la producción agropecuaria en una tasa cercana al 2% anual (Nores, 1992). Estas demandas en producción podrán ser satisfechas mediante aumentos en la productividad y/o a través de la incorporación de nuevas tierras a la producción agropecuaria, las mayores áreas con posibilidades de expansión agrícola se encuentran localizadas en el trópico húmedo (1.500 millones/ha) (Grant, 1957; ICA, 1974; IGAC, 1983).

Colombia como país tropical y por su alta biodiversidad, presenta ventajas naturales, para la producción de especies como plátano, yuca y ñame, las cuales se encuentran adaptadas a diversas regiones naturales como la Región Caribe, el Piedemonte Llanero y los Valles Interandinos.

El uso de tecnologías apropiadas facilita que este enorme potencial pueda ser aprovechado para la producción competitiva y sostenible de las regiones. En la actualidad, la producción comercial para el consumo en fresco o para la agroindustria requiere superar múltiples limitantes, que se manifiestan a lo largo de toda la cadena productiva, desde la selección de materiales genéticos adaptados a condiciones agroecológicas especificas, en el manejo de plantas propagadas a partir de vivero o por técnicas de micropropagación al ser transplantadas a condiciones de campo, debido al desconocimiento de los mecanismos de adaptabilidad o aclimatación de estas especies, que se refleja en pérdidas en la producción, uso excesivo de insumos fertilizantes y pesticidas, que aumentan los costos de producción y afectan la competitividad de estas especies, hasta la cosecha y poscosecha que incluye procesos agroindustriales.

Adicionalmente, la mayoría de las tecnologías existentes corresponden a especies de plantas adaptadas a condiciones de zona templada y subtrópico, como a zonas mediterráneas. Las especies tropicales en su mayoría cuentan con escaso conocimiento y poco desarrollo de tecnologías apropiadas, la mayoría de las cuales han sido desarrolladas a partir del conocimiento empírico de los productores y que debe ser revisado y validado por la ciencia y la tecnología.

En condiciones naturales la mayoría de las plantas tropicales adaptadas a diversos nichos ecológicos se encuentran asociadas con microorganismos del suelo, como micorrizas, estableciendo relaciones benéficas (simbióticas). Esta estrategia de la evolución ha sido muy exitosa, y a pesar de que su conocimiento se reporta desde hace más de un siglo, solo durante las últimas décadas el hombre a empezado a utilizarla en las producciones hortícolas y frutícolas, donde existen evidencias de su potencial y éxito para el desarrollo competitivo y sostenible de estas especies. Adicionalmente, las nuevas tendencias del mercado tanto mundial como regional, buscan ser más cautelosas en lo referente a la aplicación de agroquímicos y pesticidas en la agricultura, por los problemas que ocasionan sobre la salud humana.

Dentro de la diversidad de esos microorganismos del suelo, y sus diferentes interacciones, se destacan grupos de relaciones positivas como el de algunas asociaciones simbióticas micorrízicas, presentadas entre las raíces de las plantas y ciertos hongos del suelo, que juegan un papel clave en el ciclaje de nutrientes en el ecosistema y en la protección de las plantas contra estrés cultural y ambiental, que han demostrado efectos positivos en la absorción de nutrientes, dentro los cuáles el más estudiado a nivel mundial ha sido el fósforo. Las principales limitantes para la absorción de fósforo por las plantas son la baja disponibilidad de fósforo en los suelos (deficiencia del nutriente y procesos de fijación) y la baja movilidad del elemento que no permite que la planta lo pueda absorber. Las micorrizas, permiten aumentar el área de exploración de las raíces en el suelo, permitiendo una mayor zona de contacto y por tanto de absorción de nutrientes y agua, favoreciendo a las plantas que establecen relaciones simbióticas con ellas.

En Colombia, la aclimatación, la adaptación y la multiplicación de los cultivos en diversas condiciones agroecológicas, son las mayores limitantes para la producción sostenible y eficiente. Los microorganismos tienen un gran potencial para contribuir a la solución de múltiples problemas de la agricultura, dentro de los cuales, los biofertilizantes con base en Micorrizas Arbusculares (MA) son una alternativa para reducir pérdidas en los procesos de multiplicación de especies frutales, mejorar la aclimatación y nutrición de frutales de importancia actual y potencial. Estas tecnologías tienen aplicación en un gran número de especies, incorporadas a la producción de semilla de buena calidad, tanto a nivel de vivero como en el manejo de los materiales micropropagados en el área de la biotecnología vegetal (Azcón y Barea, 1.997).

Antecedentes Científicos y Tecnológicos.

Los estudios más recientes, muestran los efectos benéficos de las Micorrizas Arbusculares (MA) en el mejoramiento de la aclimatación de plantas micropropagadas (manzana, durazno), en la reducción de la mortalidad de plantas ornamentales y frutales, al crecer en sustratos con bajos contenidos de fósforo y buena aireación, que se reflejan en un incremento del peso seco de hojas y raíces, así como una floración significativamente más precoz utilizando micorrizas del género Glomus (mosseae, intraradices y viscosum) que en plantas no micorrizadas, (Olivares y Barea, 1991; Fortuna, et al., 1996).

En el ámbito mundial, se reportan múltiples experiencias a cerca de los beneficios de las micorrizas arbusculares (MA) sobre especies frutales, donde frecuentemente se compara el crecimiento de plantas micorrizas con no micorrizas, estas diferencias son atribuibles a una mayor absorción de nutrientes, mayores niveles en la producción de hormonas y mayores contenidos de clorofila (Godar, Awasthi y Kaith, 1996; Lovelock, kyllo, et al., 1997). Estas diferencias se han observado en especies tropicales como Mora Excelsa, Prioria copaifera en Caribe (Trinidad y Tobago y Panamá), y en múltiples árboles tropicales de la familia Fabacea, dicotiledóneas y angiosperma (Torti, et al., 1997). Otros autores reportan beneficios en especies como Chirimoya (Azcón y Barea, 1997), en Tamarindus indica, Parkia biglobosa, Sclerocarria birrea, Balanites aegipticae, Adansonia digitata, Codyla pinnatta, Saba senegalensis, Landolfia heudelotti, Dialium. guineensis, Anacardium occidentale, Afsellia africana, y Aphala seneganensis.( Ba Amadou, 1998).

En Colombia, el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) inició trabajos de investigación con micorrizas (MA) desde la década de los 80, donde se evaluó su importancia agronómica en cultivos tropicales como yuca y algunas pasturas. Se iniciaron trabajos de recolección de hongos nativos, aislamiento e identificación de micorrizas originarias del Valle de Cauca, Llanos Orientales, entre otras.

Como resultado de estas investigaciones se formó un Banco de Germoplasma, y algunas recomendaciones relacionadas con su biodiversidad potencial de uso en la agricultura. Existen también experiencias positivas con la aplicación de inóculos de micorrizas (Glomus, Scutellospora y Entrophospora) en frutales tropicales como arazá (Eugenia sptipitata), borojó (Borojoa sorbillis) y chontaduro (Bactris gasipaies) (Salamanca, et al, 1997). Sin embargo, se conoce muy poco en especies como mora, lulo, uchuva, papaya. Aunque existen evidencias de su alta capacidad de asociación con (MA), por lo que presentan un alto potencial para mejorar la aclimatación de plantas propagadas en vivero y posteriormente transplantadas a campo, donde frecuentemente son sometidas a condiciones de estrés por nutrientes especialmente fósforo y nitrógeno, estrés por sequía y altas temperaturas, así como problemas por toxicidad de compuestos de aluminio y sales entre otros.

Las técnicas de cultivo de tejidos in vitro, entre ellas la micropropagación o multiplicación clonal, han sido empleadas como metodologías limpias que logran aumentar significativamente los niveles de productividad de muchos cultivos. Después del enraizamiento in vitro, las vitroplantas requieren un periodo de adaptación en condiciones de vivero antes de ser llevadas a la plantación definitiva. Las micorrizas arbusculares (MA) son importantes en la supervivencia y crecimiento de muchas especies de frutales micropropagadas: Durazno (Fortuna et al., 1992 y 1998), Piña (Guillermin et al., 1992), Aguacate (Vidal et al., 1992), Uva (Schubert et al., 1987, 1988, 1990), Manzana y Pera (Branzanti et al., 1987; Granger et al., 1983), Fresas (Chavez et al., 1990; Hrselova et al., 1989; Vestberg, 1992) y Plátano y Banano (Ramcharan et al, 1995), yuca (Azcon - Barea, 1997). Las técnicas de producción in vitro no sólo permiten la formación de micorrizas (MA), sino que cuando ocurre durante fases tempranas puede ser una estrategia para mejorar el crecimiento de plantas (Gianinazzi et al., 1989). No hay reportes a nivel mundial de utilización de micorrizas en especies de name (Dioscorea)
Las micorrizas (MA) pueden ser utilizadas en la agricultura en forma de biofertilizantes tanto, en vivero o como durante el enraizamiento de vitroplantas, constituyéndose así en una alternativa valiosa para solucionar problemas de micropropagación, aclimatación y nutrición de diferentes especies de importancia en la agricultura y reduciendo al mismo tiempo los costos de producción, ya que requieren una menor aplicación de insumos fertilizantes, riego y pesticidas y a su vez permitiendo de esta forma establecer sistemas de producción más eficientes, precoces y productivos, que aumenten la sostenibilidad de los cultivos.

De esta forma, estas tecnologías pueden beneficiar y ser fácilmente transferidas a técnicos y agricultores dedicados a la producción de especies de importancia económica en la Costa Atlántica como plátano, yuca y ñame, mediante el desarrollo e implementación de metodologías de manejo y producción, tanto de micorrizas arbusculares, así como también la aplicación de humus de lombriz en módulos locales artesanales establecidos en fincas de productores.

. Beneficios por Aplicación de Micorrizas.

Las micorrizas son asociaciones entre la mayoría de las plantas existentes, con hongos benéficos, que permiten incrementar el volumen de la raíz y por tanto permiten una mayor exploración de la rizósfera y son consideradas los componentes más activos de los órganos de absorción de nutrientes de la planta, la que a su vez provee al hongo simbionte, de nutrientes orgánicos y de un nicho protector.

Las asociaciones simbióticas establecidas por las plantas y los hongos pertenecientes a los Zigomicetos, orden de los Glomales, más conocidas como micorrizas arbusculares, son consideradas en la actualidad a nivel mundial como biofertilizantes, bioprotectores y bioreguladores para la mayoría de cultivos y ya hacen parte del manejo integrado de suelos y de plagas, así como del manejo de los materiales micropropagados en el área de la biotecnología vegetal (Azcón y Barea, 1.997).

Es ampliamente conocida la multitud de ventajas que tiene una planta micorrizada con respecto a una que no lo esté. Entre éstas ventajas, se encuentran:

· Contribución a la nutrición mineral de la planta, en especial a su aporte de fósforo, por absorción, translocación y transferencia; en la nutrición nitrogenada de la planta, y en la adquisición de otros nutrientes como zinc y cobre, y se considera que probablemente. podrían translocar potasio, calcio, magnesio y azufre
· Control biológico para algunos patógenos provenientes de suelo, e incremento de la tolerancia de la planta a patógenos.
· Efecto positivo sobre el desarrollo y distribución de biomasa
· Mejoramiento de la tolerancia a condiciones de estrés hídrico y salinidad
· Influencia sobre la fotosíntesis de la planta hospedera
· Producción de hormonas estimulantes o reguladoras de crecimiento vegetal
· Incremento en la relación parte aérea/raíz de la planta micorrizada
· Aportes en recuperación de suelos por ser formadores de agregados del suelo
· Uso potencial en suelos degradados o áridos en programas de revegetación
· Interacción positiva con fijadores libres y simbióticos de nitrógeno y otros microorganismos de la rizósfera (Olivares y Barea, 1.991)

La simbiosis de endomicorriza arbuscular debe ser considerada como un elemento esencial para promover sanidad y productividad en los cultivos de importancia económica como el que ocupa éste proyecto. Beneficios máximos serán obtenidos si se inocula con hongos micorrizógenos eficientes y si se hace una selección de combinaciones compatibles de hongo - planta - suelo. En general, cuanto más temprano se establezca la simbiosis, mayor el beneficio.(Azcón y Barea, 1.997)

Importancia del Fósforo (p) en las plantas.

El fósforo es esencial para el crecimiento de las plantas y es absorbido casi enteramente en forma inorgánica. No existe otro nutriente que pueda sustituirlo. Es uno de los tres nutrientes principales, (N, K). Aunque de los elementos primarios es el requerido en menor cantidad, la disponibilidad de este, en la mayor parte de los suelos agrícolas del trópico, es limitada (Bhat,1973). El fósforo es constituyente de ácidos nucleicos, fosfolípidos, vitaminas, es indispensable en procesos donde hay transporte, almacenamiento y transformación de energía; actúa también en la fotosíntesis, respiración, división y elongación celular. Otras de sus funciones son las de estimular la formación temprana y el crecimiento de las raíces, intervenir en la formación de los órganos de reproducción de las plantas; es vital para la formación de semillas; acelera la maduración de los frutos en los cuales generalmente se almacena en altas concentraciones (Guerrero, 1991; Brokes, 1984).

El primer síntoma por falta de fósforo es el de una planta atrofiada, las hojas pueden deformarse, con deficiencias severas, se pueden producir áreas necróticas en las hojas, frutos y tallos, los síntomas generales son: germinación y crecimiento lentos, el crecimiento de la parte aérea y de las raíces se reduce. Tallos cortos y delgados, pérdida del color verde del follaje y desarrollo de una coloración verde azulosa, color púrpura en el follaje, al margen, posteriormente estos pueden secarse y morir, las hojas son pequeñas, la defoliación prematura comienza por las más viejas. Las deficiencias de fósforo traen como consecuencia una baja producción, del cultivo (Sánchez, 1981).

El origen tanto orgánico como mineral del fósforo en el suelo, supone que los procesos responsables del suministro a la planta sea de naturaleza química y biológica. Esto supone que la cuantificación de la disponibilidad de fósforo para la planta sea particularmente difícil. El predominio de una y otra forma en la solución del suelo depende del pH; bajo condiciones ácidas predomina H2P04- y en condiciones alcalinas HP4= existiendo un equilibrio entre las dos formas, cuando el pH está cercano a la neutralidad. Ambas formas son igualmente disponibles a las plantas, pero su concentración en el suelo es muy pequeña (Guerrero, 1996; Fassbender, 1989).

Como funcionan las Micorrizas en la planta ?

La colonización del hongo a la raíz de la planta puede ser originada por el micelio precedido por la germinación de esporas de resistencia que permanecen en el suelo. Las clamidiosporas que resisten condiciones adversas en el suelo, germinan frecuentemente a circunstancias favorables, emitiendo un tubo germinal, tubo que muere a no ser que encuentre y penetre con éxito en una raíz. La presencia de un sistema micelial, integrado por dos fases, un micelio externo, el cual coloniza el suelo, cuya extensión puede ser considerable, sin embargo esta característica varía, y un micelio interno que se ubica dentro de la corteza de las raíces micorrizadas (Harley, 1983; Smith, 1988).

La presencia de micelio externo constituye uno de los principales pilares de la asociación, ya que estas hifas se desarrollan más allá del suelo que circunda la raíz, trascienden la rizósfera y transportan nutrimentos directamente a la planta. Se presentan dos tipos de hifas extramatricales: las hifas de avance "runer" en el suelo y las hifas absorbentes (Harley, 1983).

Figura 78. Proceso de infección de las raíces con micorrizas vesiculo arbusculares.

Las primeras son de paredes gruesas, grandes, con proyecciones angulares muy definidas, las cuales siguen la trayectoria de las raíces en el suelo, o en algunos casos, simplemente crecen a través del suelo en busca de ellas; estas aunque absorben nutrimentos, su función primordial aparentemente, es de soporte y base permanente de la red micelial. Las hifas que penetran las raíces se inician a partir de estas hifas de avance. Las hifas absorbentes de paredes más finas, se desarrollan a partir de las de avance y se dividen dicotómicamente extendiéndose en el suelo, son las componentes del hongo que absorben los nutrimentos para transportarlos al hospedero. Su escaso diámetro les permite explorar los poros más finos del suelo, especialmente cuando estos tienen altos contenidos de arcillas y materia orgánica. No se conoce aún la distancia a la cual puede extenderse. Dada la alta relación área/volumen que genera su presencia, el micelio externo de la endomicorriza arbuscular permite que la planta pueda explorar intensamente un gran volumen de suelo (Baon, 1992).

Figura 79. Estructuras morfológicas de las micorrizas vesiculo arbuscular

A partir del micelio externo del hongo se pueden formar células auxiliares aisladas o agrupadas, cuya función no se ha determinado totalmente y grandes esporas de resistencia de paredes gruesas, las cuales pueden sobrevivir por años y cuya germinación inicia un nuevo ciclo de la simbiosis. El desarrollo de micelio interno se inicia cuando una clamidospora entra en contacto con la raíz, forman un apresorio, penetra la epidermis desarrollando hifas que crecen intra e intercelularmente. Forman enrollamientos al interior de algunas células del hospedero, extendiendo la infección longitudinalmente en la raíz, penetran a las células más internas de la corteza (Baon,1992). En este lugar, a partir de hifas intercelulares, se forman ramificaciones laterales que trascienden las paredes de las células del hospedero, cuyo plasmalema se invagina y rodea totalmente la estructura fungosa, la cual una vez en el interior de la célula, se ramifica en forma dicotómica repetidamente, dando lugar a una estructura tridimensional arborescente que se ha denominado arbúsculo. En la zona de contacto hospedero-arbúsculo se forma una matriz interfacial, en donde se ha comprobado ocurre la mayor transferencia de nutrimentos entre los asociados.

Algunos géneros de micorrizas arbusculares producen vesículas, las cuales consisten en ensanchamientos de hifas, que se disponen inter o intracelularmente, ocupando posiciones terminales o intermedias en las hifas. Las vesículas se desarrollan posterior a los arbúsculos, en las regiones más antiguas de la infección y contienen material lipídico, por lo cual se las ha aceptado comúnmente como órganos de almacenamiento de algunos de los hongos micorrizógenos arbusculares. Estas estructuras poseen una pared fina, que puede espesarse en algunas ocasiones, transformándose en clamidiospora. El hecho de encontrarlas asociadas con raíces viejas o muertas, sugiere que también desempeñan un papel como órganos de reposo o de propagación del hongo. Esta estructura la forman todos los hongos micorrizógenos arbusculares, con excepción de los géneros Gigaspora y Scutellospora (Harley, 1983; Smith, 1988).

La asociación simbiótica beneficia a la planta con un incremento en la altura, vigor, área foliar y mejora el estado nutricional en la parte aérea. En la raíz ocurren cambios anatómicos y citológicos. La asociación ocasiona cambios en la organización celular del meristemo apical y cilindro vascular de las raíces, en ellas se detienen la actividad meristemática, haciendo decrecer el índice mitótico medio y la síntesis de ADN Y ARN Formándose un tejido parenquimatoso en los ápices radicales. En contraste, los núcleos de las células corticales activados por el hongo están totalmente diferenciados e involucrados directamente con la cromatina en comparación con las células no infectadas (Baon, 1992).

En las células corticales colonizadas se realizan alteraciones en su organización que varían de acuerdo a su localización, lo que condiciona también al hongo. En conjunto, se ha encontrado que la forma y el tamaño de los núcleos se ven influenciados por la simbiosis, registrándose que se torna de mayor tamaño que los de los controles no micorrizados, sin que esto sea el resultado de una endorreduplicación del ADN, igualmente se rodean durante periodos de máxima actividad del hongo y se localiza centralmente.

Qué es un Inoculante y como lo vamos a obtener ?

Un punto definitivo en la utilización de las micorrizas es la obtención de un inoculo que sea capaz de inducir en forma efectiva la infección en el cultivo que se trata de beneficiar (Dehne, 1975).

Un aspecto importante es el de establecer cuales son los propágulos de las micorrizas vesículo arbusculares. Se acepta que en el suelo existen 3 tipos de inóculos, los cuales aunque con diferente grado de capacidad de supervivencia y potencial infectivo, puede originar la simbiosis y son : las grandes esporas de resistencia de los hongos, las raíces micorrizadas, o sus fragmentos, procedentes de plantas preexistentes y los agregados de hifas que sobreviven en el suelo. El soporte experimental de estos hechos, es concluyente en lo que se refiere a los dos primeros sistemas de inoculo aunque es más problemático el tercero (Burbano, 1989).

Debe tenerse en cuenta que uno de los grandes inconvenientes para la obtención del biofertilizante a base de micorrizas es que este hongo se propaga únicamente si se tiene una planta que le sirva de hospedero, y lograr así su multiplicación. Por lo tanto debe realizarse una cuidadosa selección de hospederos y condiciones de clima y suelo para lograr este propósito, pudiendo ofrecer al agricultor un producto confiable, que beneficie el sistema productivo donde se aplique y a su vez conserve recursos como suelo, agua y medio ambiente ya que no contiene productos químicos contaminantes.

METODOLOGÍAS EMPLEADAS PARA EL ESTUDIO DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

Gloria Amparo Corredor H.*
Ana Maria Serralde *
Margarita Ramirez**

Para la evaluación de Hongos Micorrízicos arbusculares (HMA) se han desarrollado diversas metodologías tendientes al entendimiento de la ecología y funcionamiento de esta asociación simbiótica.

Estas incluyen el aislamiento de esporas a partir de suelo, la tinción diferencial de raíces para evidenciar la colonización y metodologías moleculares para la identificación y taxonomía.

Para una buena evaluación, es básico realizar un muestreo que sea representativo. El muestreo debe hacerse a una profundidad entre 0 y 20 cm en forma de "X" o "W". Las muestras realizadas en los diferentes puntos de muestreo seleccionados se deben mezclar y homogenizar completamente.

La muestra debe secarse a temperatura ambiente hasta obtener el mínimo de humedad. Se toman entre 10 y 100 gramos de suelo, según las necesidades del estudio y se realiza

* Investigadoras Programa Nacional de Recursos Biofísicos ,CORPOICA Reg. 1
** Coordinadora Programa Nacional de Recursos Biofísicos, CORPOICA Reg. 1

el aislamiento de las esporas presentes siguiendo la metodología de tamizaje y centrifugación en gradiente de sacarosa.

Aislamiento y Conteo de Esporas

o Interpretación de la interacción en relación al éxito del proceso de esporulación
o Número relativo de esporas
o Dinámica de Poblaciones

Limitantes

o Número de esporas puede variar de acuerdo a la estación
o El tiempo de esporulación varia de una tipo de HMA a otro
o Dificultades en la identificación taxonómica

El método utilizado para el aislamiento y conteo de esporas del suelo es el descrito por Gerderman y Nicholson (1963) con algunas modificaciones. Este método se basa en suspender una muestra de suelo en agua corriente y pasarla por varios tamices de diámetro descendente. Por lo general, se utilizan de 500, 250 y 100 m con la finalidad de aislar las esporas lo más limpias posibles y/o hacer el conteo. Cuando se realiza este método, se debe tener mucho cuidado y evitar salpicaduras que puedan incidir en los resultados.

a. Tomar de 1 a 10 gramos de suelo seco y colocarlos en un beaker de 250 ml, adicionando aproximadamente 100 ml de agua.

1. Agitar con ayuda de un sheaker por 15 minutos. Después de transcurrido este tiempo, adicione agua y viértalo sobre los tamices previamente ubicados debajo de un fregadero.
2. Lavar con agua corriente el contenido del tamiz superior, con la ayuda de una manguerilla evitando salpicaduras.

3. Del tamiz de 38 m recoger con cuidado la interfase y vertirla en un tubo de centrifuga de 50 ml con 25 a 30 ml de agua.

4. Adicionar con una jeringa con manguera rígida acoplada 20 ml de solución de sacarosa 72% con Tween 80 al 2%; de manera que la solución quede por debajo del material suspendido en agua. Equilibrar los tubos y centrifugar durante 5 minutos a 2000 r.p.m.

5. Saque cuidadosamente los tubos de la centrifuga, cuidando de no romper la interfase agua-sacarosa. Con la ayuda de una jeringa, recorra toda la superficie de la interfase y un poco de esta para recoger las esporas que no atravesaron la solución.

6. Pasar el contenido de la jeringa por el tamiz de 38 m y lavar para eliminar la sacarosa.

7. Recoger el contenido del tamiz sobre papel filtro con ayuda de un embudo.

9. Hacer conteo con ayuda del un estereoscopio

6.2.2. Tinción de Raíces

o Evaluación del éxito de la colonización
o Porcentaje de raíz colonizados
o Identificación de estructuras presentes para determinar el estado de la colonización

Limitantes

o Las estructuras son transitorias
o Algunos tejidos presentan dificultades (clareo y tinción)
o La posibilidad para identificar taxonómicamente es limitada

El método utilizado para la tinción de raíces micorrizadas es el de tinción con Azul de Tripan, descrito por Phillips y Hayman (1970) y que el procedimiento es el siguiente:

1. Lavar las raíces con abundante agua corriente.

2. Cubrir las raíces con solución de KOH al 10%.

3. En esta solución, colocarlas al baño de María (90°C) durante 10 a 15 minutos.

4. Lavar con agua corriente las raíces, utilizando preferiblemente un tamiz adecuado para evitar perdidas durante el enjuague.
5. Lavado e inmersión en solución fresca de KOH al 10% y H2O2 al 10% mezclados en proporción 1:1 (V/V). Dependiendo el tipo de raíz, se deben dejar de 5 a 10 minutos.

6. Lavar en agua corriente las raíces.

7. Acidificar con una solución de HCL al 1N durante 10 minutos.

8. Decantar el HCL. Sin lavar.

9. Adicionar el Azul de Tripan al 0.05% y colocar las raíces al baño de María por 10 minutos.

10. Retirar el colorante y guardarlo en un recipiente.

11. Lavar las raíces en agua destilada y dejarlas en reposo por 12 horas para eliminar el exceso de colorante.

12. Montar en lamina y laminilla, 10 raíces de más o menos 1 cm de largo cada una.

13. Observar al microscopio.

Metodologías Moleculares aplicadas a la investigación en HMA

La diversidad de hongos MA no ha sido investigada intensivamente a pesar de que se ha encontrado que la presencia de micorrizas presenta una relación directa con la diversidad florística y los ciclos de carbono y fósforo en comunidades naturales. Esta situación se explica por la gran dificultad que implica la identificación de hongos MA, aunque la morfología de las esporas ha sido usada con propósitos de identificación, esta debe ser realizada a partir de cultivos puros (a partir de una sola espora) proceso que es lento e impredecible ya que es posible que las esporas extraídas no sean viables.

Por estas razones, los métodos moleculares pueden ser útiles en la identificación de especies. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite amplificar DNA de una sola espora, y las técnicas basadas en PCR han sido utilizadas para amplificar DNA a partir de hongos MA e identificar materiales colectados incluso al nivel de especie. Los requerimientos de cualquier método molecular aplicado a la investigación de la diversidad y ecología de hongos MA son que estos sean reproducibles usando DNA de una sola espora de hongo MA, rápidas, fáciles y suficientemente económicas para permitir el trabajo de muchas muestras.

Aunque se ha asumido por mucho tiempo que no existe ningún tipo de especificidad en la interacción hongo-planta, el conocimiento de la dinámica poblacional de micorrizas en ambientes naturales puede llevar al entendimiento de estas interacciones, lo que permite un mejor uso de este tipo de asociaciones naturales en especial en sistemas agroculturales.

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* Investigadora Programa Nacional de Recursos Biofísicos ,CORPOICA Reg. 1